Vsebina
- faze
- 1. metoda Prepoznajte bakterijo po Gramu
- 2. način Izvedite test Ziehl-Neelsen obarvanje
- Metoda 3 Proučite vedenje in videz bakterij
- Metoda 4 Razlaga vseh rezultatov
Identifikacija bakterij je zapletena naloga. Eden od razlogov je, da po ocenah na svetu živi od 10 000 do 1 milijarde bakterijskih vrst! Pravilno prepoznavanje bakterij je zelo pomembno, še posebej na medicinskem področju, kjer je pravilno zdravljenje bolezni v veliki meri odvisno od vrste mikroba, ki povzroča težave. V večini primerov se identifikacija opravi na podlagi izločanja. Če želite prepoznati bakterijo, morate opraviti teste za obarvanje, analizirati njen videz in opazovati, kako se dobro odziva na različne pogoje. Če potrebujete hiter rezultat, vzemite vzorec DNK, ki ga pošljete v laboratorij.
faze
1. metoda Prepoznajte bakterijo po Gramu
- Določimo če so bakterije Gram pozitivne ali negativne. Obarvanje z gramom je metoda delitve bakterij med dvema najpogostejšima vrstama: gram-pozitivno in gram-negativno. Prve imajo debelo celično steno, sestavljeno iz polimera, imenovanega peptidoglikan, ki ima najboljše obarvanje kot tanke stene gram-negativnih bakterij.
- Nekatere pogoste vrste gram-pozitivnih bakterij so streptokoki, stafilokoki, mikrokoki (ali mikrokoki) in listerije.
- Tu je nekaj pogostih primerov gram-negativnih bakterij: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium in Campylobacter.
- Izvedite ustrezne zaščitne ukrepe. Bakterije in kemični elementi, ki jih boste uporabili med testom, predstavljajo tveganje za vaše zdravje. Pri izvedbi testa obarvanja nosite zaščitna očala, rokavice za nitrino za enkratno uporabo in laboratorijski plašč. Ko končate, dajte rokavice in vse druge onesnažene materiale v posebno vrečko. Ne pozabite upoštevati postopkov svojega laboratorija, da se znebite vrečke za onesnažene izdelke.
- Vzorec postavite na stekleno stekelce. Za začetek testa na sterilni diapozitiv položite kapljico ali bakterijski vzorec. Nato potisnite rezilo nad prižgan Bunsenov gorilnik trikrat, da vzorec popravite in preprečite, da bi pri izpiranju ali dodajanju reagentov prišel iz plošče.
- Na rezilo dodajte 5 kapljic škrlatnega kristala. Na vzorec vlijemo pet kapljic kristalno vijolične raztopine. Počakajte minuto, da vzorec absorbira kristalno vijolično.
- Rezilo držite na mestu z zatiči za oblačila, da ne bi umazali rok.
- Rezilo temeljito sperite, da odstranite madež. Uporabite pipo ali steklenico in pustite, da voda teče zelo počasi do pet sekund, da odstranite ostanke črnila, ki se niso lepili na vzorec.
- Na diapozitiv nalijte pet kapljic madeža po Gramu. Gre za raztopino, sestavljeno iz diode, natrijevega bikarbonata in kalijevega diodida, ki povzroči, da se kristalna vijolica topi s celičnimi stenami bakterij. Vzorec nalijemo pet kapljic raztopine in pustimo eno minuto.
- Vzorec speremo z alkoholom ali mlečno kislino. Alkohol in laceton sta belilna sredstva in bosta odpravila obarvanje bakterijskih celičnih sten, če sta gram-negativna. Na vzorec vlijemo nekaj kapljic belila in pustimo delovati največ tri sekunde. Po tem poskusite pet sekund nežno sperite z vodo, da odstranite ta belilna sredstva.
- Če pustite, da belilo deluje dlje časa, lahko pride do izginotja obarvanja gram-pozitivnih bakterij, kar ima za posledico lažni negativ.
- Izvedite kontrastni test s safraninom. Safranin je rdeče barvilo, ki je v nasprotju s kristalno vijolično in tako obarva bakterije, ki jih vijolično obarvanje ne vpliva. Na vzorec nalijemo približno pet kapljic safranina in pustimo eno minuto. Po tem poskusite pet sekund nežno sperite z vodo.
- Vizualizirajte svoj vzorec pri povečavi 1000X. Bakterije bodo postale vijolične ali vijolične, če so gram-pozitivne, ali rožnate, če so gram-negativne zaradi safranina.
2. način Izvedite test Ziehl-Neelsen obarvanje
- S to tehniko odkrijte bakterije, ki hitro delujejo na kislini. Te vrste vsebujejo večjo količino lipidov, zaradi česar so bolj odporne na barvila, uporabljena pri obarvanju po Gramu. Kislinsko odporne bakterije spadajo v rod Mycobacterium, kamor spada bakterija, odgovorna za tuberkulozo (M. tuberculosis). Za barvanje kisline odporne bakterije morate uporabiti rdeče barvilo, imenovano karbolični fuksin, odporno na izpiranje s kislimi ali žveplovimi kislinskimi raztopinami.
- Izvedite ustrezne zaščitne ukrepe. Kemični in biološki materiali, ki se uporabljajo pri obarvanju Ziehl-Neelsen, so lahko nevarni. Poleg tega boste morali uporabiti tudi vire toplote, kot so šoba Bunsen, električni grelec ali alkoholna svetilka. Za izvedbo testa upoštevajte spodnja navodila.
- Obujte si očala, rokavice iz nitrila in laboratorski plašč.
- Pazite, da ne vdihavate hlapov iz barvil in beliv in ne dovolite, da vam kapljice poškropijo oči ali kožo. Posode naj bodo odprte pod pokrovom.
- Pri segrevanju rezila bodite zelo previdni. Večina uporabljenih kemikalij je vnetljiva. Na diapozitivih ali drugi opremi so lahko tudi sledi vnetljivih snovi.
- Pripravite rezilo. S krožnimi gibi enakomerno razporedite majhno količino bakterijskega vzorca v središču sterilnega diapozitiva. Vaš vzorec naj zavzame približno 10 mm do 20 mm.
- Posušite rezilo. Rezilo postavite na sušilno konstrukcijo s primerom, obrnjenim navzgor. Pustite, da se naravno posuši 30 sekund. Ne poskušajte posušiti rezila s krpo.
- Vzorec zavarujte s toploto. Z vzorcem navzgor dvakrat ali trikrat potisnite rezilo čez prižgan Bunsen gorilnik. Lopatico lahko postavite tudi na električni grelec, tako da nastavite temperaturo med 65 ° C in 75 ° C za vsaj dve uri. Pazite, da vzorca ne zavrete ali ne zažgete.
- Na rezilo dodajte karbolični fuksin. Na diapozitiv nalijte več kapljic te raztopine. Nalijte dovolj, da v celoti prekrijete vzorec.
- Za pritrditev barvila segrejte rezilo. Drsnik previdno segrejte nad gorilnikom Bunsen ali alkoholno svetilko z vzorcem, usmerjenim navzgor, ali pa ga položite na električni grelec. Lopatico segrejte na 60 ° C ali dokler ne začne sproščati pare. Pustite, da barvilo deluje pet minut.
- Če uporabljate električni grelec, ga vklopite pri 60 ° C. Če se odločite za alkoholno svetilko ali gorilnik Bunsen, pričakujte, da boste videli hlape.
- Da bi rezilo pet minut obdržali na želeni temperaturi, ga občasno segrejte.
- Pazite, da vzorca ne zavrete, ne opečete ali osušite.
- Rezilo sperite s hladno vodo. Pustite, da se ohladi pet minut, in rahlo sperite nekaj sekund s čisto vodo. Uporabite vodo iz pipe ali steklenico, da odstranite madeže v barvi, ki se niso lepili na vzorec.
- Na vzorec vlijemo kisli alkohol ali žveplovo kislino. Za popolno prekrivanje vzorca uporabite prostornino 3 vol.% (V / v) alkohola ali 20% žveplove kisline. Pustite, da kislina deluje, dokler barva ne zbledi in doseže zelo svetlo roza odtenka. Postopek običajno traja približno deset minut.
- Za izpiranje rezila uporabite čisto vodo. Rezilo nežno sperite pod pipo ali s stiskalno steklenico. Odstranite vse ostanke kisline in barvila.
- Dodajte kontrastno sredstvo. Ko ste splaknili drsnik, nalijte barvilo malahitno zeleno ali metilen modro. Ti dve raztopini ustvarjata modrikasto ali zelenkasto ozadje, na katerem se bo pojavilo rdeče barvilo, pa tudi drugi biološki materiali, kot so človeške celice in ne kislinsko odporne bakterije. Snovi pustite delovati eno do dve minuti.
- Izperite in posušite rezilo. Temeljito sperite z vodo, da odstranite odvečen kontrast. Ko končate, posušite zadnjo stran rezila s suho krpo in pustite, da se naravno posuši na stojalu.
- Vizualizirajte svoj vzorec pri povečavi 1000X. Kislinsko odporne bakterije bodo postale rdeče ali temno rožnate. Druge bakterije, nebakterijske celice in podnožje rezila bodo postali zeleni ali modri.
Metoda 3 Proučite vedenje in videz bakterij
- Analizirajte obliko bakterije. Po opravljenem testu obarvanja, da ugotovimo, ali so bakterije gram-pozitivne, gram-negativne ali kislinsko odporne, je čas, da vrste natančneje določimo. Najprej analizirajte obliko bakterij na diapozitivu. Tri najpogostejše oblike so kaki (sferične), spirale in bacili (oblika palice).
- Obstaja več variant teh oblik. Na primer, bakterije okrogle oblike (koki) se lahko pojavijo v parih (diplokoki), v verigah, gomilah ali v štirih skupinah (tetrade).
- Ugotovite, ali so bakterije aerobne ali anaerobne. Vzemite dva vzorca bakterij in ustvarite dve ločeni kulturi. Luna mora biti anaerobna (zraste brez kisika), druga pa mora biti aerobna (zrasla s kisikom). Anaerobno kulturo shranjujte pri 35 ° C na mestu brez kisika vsaj 48 ur, preden opazite rast.
- Če bakterije rastejo v okolju brez kisika, vendar niso izpostavljene kisiku, to pomeni, da so anaerobne.
- Čeprav se razvijajo v kisikovem okolju, vendar ne v odsotnosti kisika, so aerobni.
- Ko se razvijejo v obeh okoljih, govorimo o fakultativnih anaerobnih bakterijah.
- Izvedite test gibljivosti. Bakterija je mobilna, če se lahko giblje sama z enim ali več flagelami. Stopnja gibljivosti je zelo pomembna pri identifikaciji nekaterih bakterijskih vrst. Obstaja več vrst gibljivosti, vendar je najvarnejši in najbolj berljiv način poltrden medij.
- Ustvari kulturo za preskus gibljivosti. Pripravite kulturo bakterij v kulturnem juhu. Za pripravo juhe po želji sledite spodnjim navodilom.
- Kulturo inokuliramo v poltrden agar za preskuse gibljivosti. Del kulture juhe premažemo s sterilno iglo za inokulacijo. Iglo previdno posadite v poltrdno cev dagarja, kot je TTC lagar, ki ste jo pripravili za test. Igla mora prodreti 2/3 agarja.
- Ko končate, iglo previdno odstranite, pri tem pazite, da ne presežete meja območja inokulacije.
- Cev inkubirajte pri 30 ° C 48 ur.
- Preberite rezultat testa. Agar za preskus gibljivosti se ob stiku z bakterijami obarva rdeče. Če so mobilni, se bo ta rdeč ali rožnat odtenek razširil po snovi. V nasprotnem primeru bo obarvanje omejeno na mesto injiciranja.
Metoda 4 Razlaga vseh rezultatov
- Zberite svoje komentarje. Če želite poznati vrsto bakterij, boste morali zbrati podatke, pridobljene iz kultur, preskuse obarvanja in opazovanje oblik. Če pregledujete bolnikove vzorce, lahko simptomi, ki jih predstavljajo, pomagajo tudi pri določanju ustrezne vrste bakterij.
- Če testi na primer pokažejo, da so bakterije gram-negativne, anaerobne, negibne in pri bolniku opazite simptome, kot so bolečine v trebuhu, slabost in bruhanje, je verjetno, da bolnik zboli za okužbo z bakterioidi. fragilis.
- Oglejte si bazo podatkov. Na svetu je na tisoče vrst bakterij. Vsega na pamet ni mogoče vedeti. Verjetno se boste morali posvetovati s klinično mikrobiološko knjigo ali spletno bazo podatkov, če želite primerjati rezultate testov z informacijami o bakterijskih vrstah.
- Obstajajo odlični spletni viri za prepoznavanje bakterij, vendar je večina teh baz podatkov na voljo v angleščini, vključno s Patricbrc.org in GlobalRPh. Kljub temu lahko še vedno najdete koristne informacije na spletnem mestu INRA International Microbial Resource Center.
- Naredite genetski test, da veste natančne vrste bakterij. V nekaterih primerih boste morda morali identificirati vrste bakterij. Najhitrejša in najpreprostejša metoda je izvesti DNK test. DNK testi so koristni tudi za prepoznavanje bakterij, odpornih na tradicionalne oblike obarvanja in kulture. Dandanes so DNK testi na mikroorganizme zelo hitri in so lahko pripravljeni v manj kot dveh urah.
- Če nimate dostopa do laboratorija, ki izvaja genetsko zaporedje mikroorganizmov, pošljite bakterijski vzorec specializirani agenciji.